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免疫組化(IHC)SP法,原來(lái)如此簡(jiǎn)單!

 更新時(shí)間:2024-09-23 點(diǎn)擊量:69

免疫組化,是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理-抗原抗體反應(yīng),即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)),對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究,稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。

一、SP法步驟

1. SP三步法

脫蠟梯度水化滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶抗原修復(fù)封閉一抗孵育二抗孵育SP反應(yīng)DAB顯色蘇木素復(fù)染常規(guī)脫水透明封片

2、免疫組化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

脫蠟和水化

抗原修復(fù)

滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素

血清封閉

一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間

切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)

⑦DAB顯色

復(fù)染

脫水透明

封片

二、異常分析

1、非特異性染色

抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。

一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色,建議試用單克隆抗體。

內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細(xì)胞多的組織),需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色。

非特異性組分與抗體結(jié)合,這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果。

⑤DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高。

⑥PBS沖洗不充分,殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色,在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要。

標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片,這容易增強(qiáng)非特異性著色。

2、呈陰性結(jié)果

抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤。不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果,抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng),必須摸索最佳濃度。

抗原修復(fù)不全,對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來(lái)打開(kāi)抗原表位,以利于與抗體結(jié)合。

組織切片本身這種抗原含量低。

血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。DAB孵育時(shí)間過(guò)短。

細(xì)胞通透不全,抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。

三、重要信息

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