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ELISA檢測(cè)方法

 更新時(shí)間:2024-09-10 點(diǎn)擊量:645
  ELISA檢測(cè)方法
 
  一、elisa直接法
 
  直接ELISA法是將抗原固定在96孔板上,然后用酶標(biāo)抗體直檢測(cè)抗原。直接ELISA實(shí)驗(yàn)步驟少,檢測(cè)速度快,不需要用到二抗,避免了交叉反應(yīng),測(cè)定結(jié)果不容易出錯(cuò)。但是由于直接ELISA的抗原通過吸附而不是特異性固定的,樣本中的所有蛋白質(zhì)(靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白)都會(huì)固定在96孔板上,導(dǎo)致背景比較高。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要標(biāo)記與其特異性結(jié)合的一抗,實(shí)驗(yàn)顯得不太靈活。另外由于沒有使用二抗,沒有放大作用,降低了測(cè)定的靈敏度。
 
  優(yōu)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)步驟少,檢測(cè)速度快,因無須使用二抗可避免交互反應(yīng)。
 
  缺點(diǎn):試驗(yàn)中的一抗都得用酶標(biāo)記,但不是每種抗體都適合做標(biāo)記,費(fèi)用相對(duì)提高。
 
  二、Elisa間接法
 
  在直接法的基礎(chǔ)上,Lindström 和Wager 引入二抗建立了間接 ELISA 方法,通過使用一抗能結(jié)合多個(gè)二抗,從而放大了檢測(cè)靈敏度,同時(shí),不需要標(biāo)記一抗,只需要加入抗一抗種屬的標(biāo)記二抗就可以進(jìn)行檢測(cè),克服了直接法的局限性。
 
  優(yōu)點(diǎn):只要更換不同的固相抗原,就可以用標(biāo)記二抗檢測(cè)各種與抗原相結(jié)合的抗體,二抗可以加強(qiáng)信號(hào),不加標(biāo)記一抗體則能保留一抗最多的免疫反應(yīng)性。
 
  缺點(diǎn):存在交叉反應(yīng)的可能性,抗原純度不夠會(huì)導(dǎo)致非特異結(jié)合,產(chǎn)生假陽性。
 
  三、Elisa夾心法
 
  雙抗體夾心法將捕獲抗體固定在96孔板上,加入樣品,通過捕獲抗體結(jié)合目標(biāo)抗原,洗去未結(jié)合的雜質(zhì)后,加入酶標(biāo)檢測(cè)抗結(jié)合目標(biāo)抗原的另一表位(如果檢測(cè)抗體不帶有標(biāo)記,則需使用酶標(biāo)二抗與檢測(cè)抗體結(jié)合,這種稱為間接夾心ELISA),形成“sandwich” 的結(jié)構(gòu),此時(shí)的抗原就像被兩個(gè)面包片夾著的奶油,通過酶催化發(fā)生顯色反應(yīng)就可以測(cè)定抗原的含量。雙抗體夾心法測(cè)抗原,對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為捕獲抗體和酶標(biāo)檢測(cè)抗體。適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原,不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原,因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。
 
  優(yōu)點(diǎn):高靈敏、高專一性,抗原無須事先純化,進(jìn)行操作時(shí)不需稀釋,夾心ELISA尤其適用于復(fù)雜樣品的分析,因?yàn)榭乖唤?jīng)純化仍具能有高靈敏度和特異性。
 
  缺點(diǎn):抗原分子上需擁有兩個(gè)不同抗原決定簇,對(duì)配對(duì)抗體要求很高,如果沒有標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒或者已經(jīng)通過測(cè)試的配對(duì)抗體,則需要進(jìn)行配對(duì)抗體定制并進(jìn)行優(yōu)化,因?yàn)榻档筒东@抗體與檢測(cè)抗體之間的交叉反應(yīng)是非常重要的。
 
  四、Elisa競(jìng)爭(zhēng)法
 
  競(jìng)爭(zhēng)法是所有ELISA 里最為復(fù)雜的測(cè)試方法,通過檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)信號(hào)的強(qiáng)度來反應(yīng)樣品中的抗原水平,通常以酶標(biāo)抗原作為競(jìng)爭(zhēng)抗原,與樣品來源的抗原形成直接競(jìng)爭(zhēng),搶奪過量的固定化抗體上的結(jié)合位點(diǎn),因此競(jìng)爭(zhēng)信號(hào)越高,說明樣品中的抗原越少。競(jìng)爭(zhēng)法ELISA既可用于檢測(cè)抗體,也可用于檢測(cè)抗原。
 
  優(yōu)點(diǎn):可用于檢測(cè)不純的樣品,且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高,特異性好。
 
  缺點(diǎn):操作方法更復(fù)雜一些,產(chǎn)品性能取決于抗體的親和力。整體的敏感性和專一性都較差。
 
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